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天花粉蛋白的融合表达与抗肿瘤效果的探讨

发布时间:2020-01-20 09:36

  摘要:天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS)是从中药植物栝楼块根中提取的一种 I 型核糖体失活蛋白,具有抗 HIV 感染、抗肿瘤等多种生物学活性。天花粉蛋白对黑色素瘤细胞、绒毛膜癌细胞等具有一定毒性,但由于缺乏对成纤维细胞、肝癌细胞等多种肿瘤细胞的敏感性,限制了在抗肿瘤方面的应用。细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides, CPPs)是一类富含碱性氨基酸的短肽,具有介导蛋白质等生物活性分子高效进入细胞的能力。本研究就一种人源性穿膜肽 HBP 与重组天花粉蛋白融合表达,以此介导TCS 高效进入肿瘤细胞内发挥其药理效应等进行探索。

  首先将TCS与 HBP 在原核表达系统中融合表达,经镍柱亲和层析进行样品纯化,纯化的样品经 MTT、激光共聚焦显微镜观察、流式细胞术等实验方法进行分析,考察其穿膜效果及体外诱导细胞凋亡能力、凋亡途径的研究。结果显示,细化一下,表明融合蛋白TCS-HBP相对于TCS而言具有更为显著的体外抑制Hela、B16、MCF-7肿瘤细胞生长能力,且具有更广的细胞谱。Western Blot 实验结果cleaved-caspase-3 表达水平存在显著上调,而Bcl-2 表达水平存在显著下调,与细胞凋亡线粒体途径中各个效应物理论表达水平的调整趋势完全吻合,推测 TCS-HBP 可能通过线粒体途径诱导 Hela 细胞凋亡。本研究以穿膜肽与抗肿瘤蛋白药物融合表达的穿膜策略为导向,选择人源性穿膜肽与抗肿瘤药物天花粉蛋白融合表达,通过对其穿膜效果的考察及体外诱导细胞凋亡能力、凋亡途径的研究,为抗肿瘤药物 TCS 运输及活性提高提供了一种新的策略。

  关键词:天花粉蛋白,穿膜肽,凋亡,药物运输质粒构建鉴定,表达蛋白分子量等信息

  1 引言

  1.1 天花粉蛋白

  天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS)是从葫芦科中药植物栝楼块根中提取得到的主要生物活性组分,在中国作为引产药使用已长达 1500 多年之久[1]。过去的 20 多年里,TCS以其潜在的抗肿瘤活性而备受关注,许多研究已经表明 TCS 无论在体外还是体内均对多种肿瘤细胞株具有细胞毒性[2]。 TCS 由于其有限的穿透细胞膜能力、抗原性及较短的胞内半衰期而具有一定的临床应用局限性[3]。先前研究已报道 TCS 通过偶联葡聚糖(Dextran)或聚乙二醇(PEG)、删除 C 末端 7 个氨基酸等策略可在一定程度上消除其抗原性并延长胞内半衰期[4]。与此同时,TCS 有限的穿透肿瘤细胞膜能力成为亟待解决的问题。TCS 与细胞穿膜肽融合表达为解决这一问题提供了新思路,从而极大地提升了 TCS 作为新型抗肿瘤药物的临床应用价值。

  1.1.1 天花粉蛋白的结构与功能

  TCS 是由 247 个氨基酸残基组成的单多肽链构成,分子量为 27 kDa。氨基酸序列分析表明,TCS 的 cDNA 编码一段由 289 个氨基酸组成的多肽链,在此多肽链的 N 末端具有一个 23 个氨基酸残基组成的信号肽,C 末端具有一个 19 个氨基酸残基的前导肽,信号肽与前导肽降解之后,形成 247 个氨基酸残基的成熟形式的 TCS。Pan 等基于 TCS的氨基酸序列,使用 0.26 nm 分辨率的 X-射线衍射构建了 TCS 的分子结构模型[5]。

  功能方面,TCS 属于 I 型核糖体失活蛋白(Ribosome inactivating protein, RIP),TCS仅有一个亚基(即 A 链),而 II 型核糖体失活蛋白则由具有毒性的 A 链与凝集素样亚基(即 B 链)组成。TCS 具有与其他 RIPs 相似的作用方式,TCS 具有 N-糖苷酶活性使其可以切除 28S rRNA 4324 位腺嘌呤残基,从而导致对于细胞内转录与蛋白合成的抑制作用[1]。

  1.1.2 降低天花粉蛋白的免疫原性并延长其胞内半衰期

  TCS 具有包括引产、抗肿瘤、抗 HIV 感染等多种治疗用途。TCS 通过静脉注射进入体内即可引发 IgG 与 IgE 的产生[4]。然而,TCS 有限的肿瘤细胞膜穿透能力、免疫原性及较短的胞内半衰期却在一定程度上限制其临床应用。许多研究已经实现在基本不影响其抗肿瘤、抗 HIV 感染等生物学活性的前提下降低其免疫原性并延长其胞内半衰期[6]。 已有研究尝试将 TCS 偶联葡聚糖或聚乙二醇从而掩盖其抗原性位点。当 PEG 耦联到 TCS 潜在抗原性位点 S7、K173 以及 Q219 后 IgE 反应存在 4 ~ 16 倍不同程度的降低(表 1.1)。相应的,当[K173C]TCS 偶联葡聚糖 T40 后,动物模型几内亚猪因剧烈过敏反应致死数目从 5 降为 0(表 1.2)。

  K173C偶联葡聚糖后没有造成几内亚猪的死亡,这表明偶联葡聚糖可以极大地减少免疫原性反应 [3]。作为相对较小的蛋白,TCS 被肾小球滤过作用迅速清除并进入尿中。野生型的 TCS胞内半衰期为 9 分钟。偶联聚乙二醇和葡聚糖可以 TCS 胞内循环半衰期[6]。将葡聚糖偶联至 TCS 的 R29 位、K173 位能够使其在小鼠中的胞内半衰期延长 27 倍。将 PEG5000偶联至 TCS 的 Q219 位、K173 位以及 S7 位能够使其在小鼠中的胞内半衰期延长 6 倍。PEG20000 相对于 PEG5000 而言,由于偶联 TCS 的有效大小的增加而被认为是降低抗原性及延长胞内半衰期的更为优秀的偶联剂。偶和蛋白对于蛋白酶的抵抗作用可能对于延长 TCS 胞内半衰期具有一定作用。

  TCS 偶联 PEG 或 Dextran 后其体外细胞毒性与核糖体失活活性通常有所降低,这是基于偶联的 PEG 或 Dextran 能够阻碍 TCS 活性位点并可能妨碍修饰后 TCS 进入细胞这一事实造成的[7]。

  1.1.3 天花粉蛋白通过受体介导的内吞途径进入细胞

  TCS 对于绒毛膜癌细胞 JAR 细胞具有较强的细胞毒性而对于肝癌细胞 H35 细胞仅仅具有轻微毒性已成共识[8]。普遍认为,TCS 对于绒毛膜癌细胞 JAR 细胞与肝癌细胞H35 细胞具有不同的细胞毒性是由于 TCS 进入细胞的不同比例以及 TCS 在细胞内转到至靶点的不同效率导致的[9]。TCS 进入细胞比例的研究表明在一定的相同时间内进入JAR 细胞内 TCS 的比例是 H35 细胞的三倍。这表明 TCS 进入 JAR 细胞存在特殊的机理[10]。 研究表明 TCS 与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)以及兆蛋白相互作用,且这种结合能够被受体有关蛋白(RAP)所抑制[10]。JAR 细胞富含 LRP,研究发现 TCS 进入进入此类细胞可被 RAP 抑制,表明 TCS 进入 JAR 细胞的内化作用是由 LDL 受体家族介导的[10]。兆蛋白在肾近曲小管上皮细胞中富集,且对于滤过蛋白的吸收发挥着重要作用[11]。高浓度的 TCS 将会损伤肾近曲小管[12]且研究表明这种细胞毒性是由于兆蛋白介导的 TCS 内吞导致的[10]。内吞之后,TCS 在低 pH 环境中可能会诱导囊泡裂解而后从包裹的囊泡中逃逸,这是由于 TCS 在低 pH 环境中可能会造成囊泡膜不稳定导致的[13]。 基于以上研究结果,天花粉来源抗肿瘤药物 TCS 具备极为有限的肿瘤细胞膜穿透能力,对于成纤维细胞、肝癌细胞等细胞株不敏感,这在一定程度上限制了 TCS 作为抗肿瘤药物的临床应用。

  1.1.4 天花粉蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的可能途径

  长期以来,人们认为 TCS 处理后细胞死亡仅是因为 TCS 抑制了细胞内蛋白质的合成并继而诱发坏死。然而,近期研究表明,TCS 可诱发几种细胞株经典的凋亡过程[14-16]。

  细胞在坏死或凋亡后将会走向死亡。凋亡具备区别于坏死的典型的形态学与生物化学变化,这些变化包括染色质的聚集于断裂、特定蛋白酶与核酸酶的激活以及细胞 G1 期阻滞现象[14](图 1-1)。

  图 1-1 TCS 诱导 JAR 细胞凋亡

  Figure 1-1 TCS induces apoptosis in JAR cells

  注:(A)DNA 的聚集与片段化; (B)JAR 细胞 G1 期阻滞现象; (C)流式细胞术分析表明 TCS 以时间依赖的方式诱导JAR 细胞凋亡

  近期研究已经揭示的 TCS 诱导相关肿瘤细胞株凋亡的可能途径包括:TCS 通过诱导活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的产生从而诱导肿瘤细胞凋亡[14];TCS 通过环腺嘌呤单磷酸(Cyclic Adenosine Monophosphate, cAMP)途径诱导肿瘤细胞凋亡[2];TCS通过半胱天冬酶家族以及线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡[15];TCS 通过调节凋亡相关基因诱导肿瘤细胞凋亡[17];TCS 通过调节细胞骨架诱导细胞凋亡[18]。此外,TCS 诱导肿瘤细胞凋亡过程还存在其他未知途径有待阐明。汇总 TCS 诱导肿瘤细胞凋亡的可能途径制成下图(图 1-2)。

  图 1-2 TCS 诱导肿瘤细胞凋亡途径汇总

  Figure 1-2 TCS induction of apoptosis pathway in tumor cells

  注:核糖体失活与凋亡诱导之间的联系(黄色标注)以及 ROS 的产生位点(红色标注)目前为止尚未完全阐明。

  (—)表示抑制;[Ca2+]表示细胞内 Ca2+浓度;[Ca2+]e 表示细胞外 Ca2+浓度;P 表示磷酸化;M 表示线粒体;ER 表示内质网;R 表示核糖体。

  1.2 细胞穿膜肽

  细胞质膜选择性透过阻止了绝大多数外源试剂分子进入细胞。由于许多治疗药物与报告分子必须内化进入细胞才能发挥其生物学活性,因此,对其而言穿过细胞膜进入细胞就显得尤为重要。细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides, CPPs)是出于此目的而应用的一类高效转运蛋白[19]。CPPs 是一类短的阳离子氨基酸序列,具有显著的细胞膜转导能力。CPPs 自 1988 年被发现以来,已被用于运输各种货物分子,包括小分子、核苷酸、抗体以及纳米颗粒[20]。CPPs 能够通过无受体介导、非能量依赖的方式高效介导多肽、蛋白质、核苷酸等进入哺乳动物细胞,且在一定能度范围内不会造成细胞本身的的损伤。这一发现为具有治疗作用的蛋白质等生物大分子进入哺乳动物细胞提供了有效运输载体。在药物体内转运、临床药效评价等方面具有良好的应用前景[21]。

  1.2.1 细胞穿膜肽的分类与性质

  细胞穿膜肽就其氨基酸组成与 3D 结构而言具有极大的多样性。依据不同的分类标准可以将已知的多种细胞穿膜肽分为不同的种类。比如,依据细胞穿膜肽的物理化学性质可以将其分为阳离子型、阴离子型与中性序列。同时,细胞穿膜肽又可以被分为疏水型与两亲型[22](图 1-3)。

  图 1-3 细胞穿膜肽依据平均净电荷及分类的分布图

  Figure 1-3 distribution diagram of membrane peptides based on average net charge and classification

  虽然细胞穿膜肽的特定分组中具有高度的序列同一致性以及类似的结构特征,但总体而言细胞穿膜肽不具有序列同源性。这种结构的多样性导致了基于不同细胞株及被转运货物分子等其他条件下的细胞摄入模式的不同以及摄入水平的不同[23]。

  1.2.2 细胞穿膜肽的穿膜过程及其机制

  内吞作用与直接转转导穿过细胞膜是细胞穿膜肽获得进入细胞的两大主要机制。其中,内吞作用又可以通过各种机理发生,具体可被分为网格蛋白依赖的内吞作用(clathrin-dependent endocytosis, CDE)与网格蛋白非依赖的内吞作用(clathrin-independent endocytosis, CDI)。对于网格蛋白依赖的内吞作用而言,膜蛋白的胞质域被连接蛋白所示别,并被包裹进网格蛋白包被的囊泡中,从而被携带进入细胞。网格蛋白非依赖的内吞作用可以多种形式发生,比如巨胞饮、小窝蛋白与脂筏介导的内吞作用[24]。

  许多阳离子细胞穿膜肽的摄入模式依据其浓度不同而有所改变。当细胞穿膜肽的浓度超过一定阈值之后,可观察到迅速的胞内摄入,这表明细胞穿膜肽通过直接转导的方式进入细胞。相应的,当细胞穿膜肽的浓度低于一定的阈值时,摄入则主要通过内吞途径发生。这种现象在包括 R9、PenetratingTM、Tat 来源的多肽以及乳铁蛋白的多种阳离子多肽中被观测到[25-27]。这种浓度阈值因细胞穿膜肽种类的不同而存在明显差异。

  许多阳离子细胞穿膜肽进入细胞的第一步是其与细胞表面糖胺聚糖静电相互作用的形成[28]。这种相互作用可以诱导细胞表面的糖胺聚糖成簇,肌动蛋白重组,以及通过包括直接转导与内吞作用在内的多种内摄途径导致的细胞摄入[29]。细胞穿膜肽的摄入与细胞内转导见模式图(图 1-4)

  图 1-4 细胞穿膜肽细胞摄入及胞内运输模式图

  Figure 1-4 cell transmembrane peptide cell intake and intracellular transport pattern

  注:(1)细胞穿膜肽以共价以及非共价策略内摄进入细胞(2)细胞穿膜肽或细胞穿膜肽货物分子复合物通过细胞表面蛋白聚糖平台结合到细胞外基质;(3)糖胺聚糖平台成簇触发鸟苷三磷酸水解酶的选择性激活以及肌动蛋白网络重组;(4)细胞膜流动性的增加以及微结构域的动态变化促进了 CPP-NCS 与 CPP-CS 经由膜融合的胞内摄入;(5)内吞途径 a.小窝蛋白依赖,b.网格蛋白依赖,c.小窝蛋白与网格蛋白非依赖;(6)巨胞饮。内吞捕获后,CPP-CS 能够从溶酶体裂解中逃逸并进入细胞质与细胞核;(7)依旧滞留在早期或晚期内吞体中;(8)被转运到高尔基体或内质网。

  1.2.3 细胞穿膜肽的应用与局限

  已有研究表明,细胞穿膜肽相对于其他生物大分子的转运方式而言在转导方面具有独特的巨大优势与潜能。细胞穿膜肽可以介导蛋白质(蛋白药物、绿色荧光蛋白等)、多肽、核苷酸、化学小分子药物、荧光素、脂质体、纳米颗粒以及乳铁蛋白等进入细胞,就所携带货物分子的大小而言具有极大的适用范围。细胞穿膜肽介导多肽类药物进入细胞不但可以增加其生物学活性,而且有研究表明部分穿膜肽携带货物分子的转运具有一定的器官或细胞特异性。

  截至目前,有效利用 CPPs 介导生物大分子药物进入细胞以发挥其治疗作用方面的实验进展与现实应用还极少见诸报道。这一药物运输策略是否会因 CPPs 而引入潜在的细胞毒性以及免疫原性、CPP 货物分子复合物因内吞体捕获而最终代谢性降解等问题尚未引起足够重视。因此,需要进一步进行细胞穿膜肽药物复合物药理性质研究。

  1.2.4 人源性穿膜肽 HBP

  HBP 是本实验室自主发现的一种人源性穿膜肽,研究表明,HBP 具有高效地细胞穿膜活性[28]。相对于病毒来源、抗菌肽来源以及多数人工合成等外源性细胞穿膜肽而言,人源性细胞穿膜肽具有更低的细胞毒性及免疫原性,从而为介导蛋白药物等进入人细胞提供了更为理想的选择。

  1.3 目的与意义

  天花粉蛋白(TCS)作为大分子抗肿瘤蛋白药物极具临床应用价值。但由于有限的肿瘤细胞膜穿透能力、免疫原性以及较短的胞内半衰期等限制 TCS 的临床应用。大量体外细胞实验及动物实验研究表明,通过偶联葡聚糖或聚乙二醇等可有效降低其免疫原性并提高其在生理环境下的稳定性,这种改善对于 TCS 本身的抗肿瘤等生物学活性存在极低或几乎没有影响。与此同时,TCS 有限的肿瘤细胞膜穿透能力成为限制其临床应用的关键因素。

  细胞穿膜肽(CPPs)高效的转导能力为介导大分子药物蛋白进入肿瘤细胞提供了新思路。但病毒来源、抗菌肽来源以及人工合成等异源穿膜肽在人的临床治疗方面存在潜在的细胞毒性及免疫原性等风险。人源性穿膜肽 HBP 已被证实不具备这些风险,且同样可以高效介导蛋白药物进入细胞膜。

  本研究以穿膜肽与抗肿瘤蛋白药物融合表达的穿膜策略为导向,选择人源性穿膜肽与抗肿瘤药物天花粉蛋白融合表达,通过对其穿膜效果的考察及体外诱导细胞凋亡能力、凋亡途径的研究,为抗肿瘤药物 TCS 运输及活性提高提供了一种新的策略。

  1.4 研究内容

  在实验室保藏质粒 EGFP-HBP-28b 的基础上构建目标质粒 TCS-HBP-28b,然后 TCS 与 HBP 在原核表达系统中融合表达,经镍柱亲和层析进行样品纯化,纯化的样品经 MTT、激光共聚焦显微镜观察、流式细胞术等实验方法进行分析。通过 Western Blot 在翻译水平上探究 TCS 及融合蛋白诱导 Hela 细胞凋亡的可能途径。

  1.5 研究目标

  本研究将 TCS 与可以高效介导生物活性大分子穿膜的穿膜肽融合表达,辅助 TCS 穿膜,以期提高 TCS 对于癌细胞细胞膜的穿透能力并扩展 TCS 敏感细胞的细胞谱,为 TCS 高效用药提供有效参考。

  2 实验内容

  2.1 材料

  2.1.1 菌株及生物试剂

  2.2 方法

  2.2.1 质粒构建

  重组质粒 NcoI-TCS-BamHI-pET28b 与 NcoI-EGFP-BamHI-HBP-28b 为实验室保藏,在此基础上,将目的基因片段 TCS 与载体质粒 EGFP-HBP-28b 分别进行双酶切,然后将 TCS 插入到 EGFP 位置即可获得目标重组质粒 NcoI-TCS-BamHI-HBP-pET28b。 以 TCS-pET28b 为模板通过 PCR 扩增目的基因 TCS,PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测。采用 PCR 产物纯化试剂盒对 PCR 产物进行纯化,纯化后产物经琼脂糖凝胶电泳检测。将载体质粒 NcoI-EGFP-BamHI-HBP-28b 转化入大肠杆菌表达菌 JM83 扩增并抽提质粒,经琼脂糖凝胶电泳检测。将 PCR 产物与载体质粒分别采用 NcoI 与 BamHI 双酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测。分别切胶回收,胶回收产物经琼脂糖凝胶电泳进行连接前检测。连接产物转化入 JM83 感受态细胞并涂布于含 50 μg/mL 卡那霉素抗性平板,从培养一段时间后的单菌落中随机挑取进行菌落 PCR 鉴定,挑取阳性克隆单菌落接入含 50 μg/mL卡那霉素抗性的 30 mL 液体 LB 培养基(一级瓶)中,37 ℃培养 15 小时后抽提质粒,送测序。相关酶信息、引物序列、扩增条件等要有层次进行描述!!

  2.2.1.1 转化大肠杆菌 常规方法不用写的太细,否则重复率会很高!

  1) 准备冰水浴,从-80 ℃取冻藏的大肠杆菌感受态细胞置冰 2 min 以上使其溶化;

  2) 取 1 ~ 3 μL 质粒或 10 μL 连接产物加入到感受态细胞中,置冰冰水浴 30 min;

  3) 42 ℃热击 90 s,然后迅速转到冰上,置冰冰水浴 2 min 以上;

  4) 每管感受态细胞中加入 900 μL 液体培养基,37 ℃ 摇床培养 1.5 小时;

  5) 转化连接产物,须先在室温下离心(5000 rmp,5 min),去除 900 μL 上清,重悬菌体;

  6) 取 100 μL 菌液涂布于含有 100 μg/mL 相应抗性的固体培养基平板上,37 ℃培养箱倒置培养 14 小时左右。

  2.2.1.2 大肠杆菌培养

  1) 大肠杆菌液体培养:

  一级瓶(含有 30 mL 液体 LB 培养基的锥形瓶培养基)培养:加 0.1 %抗性,37℃,180 rmp 摇床培养 12 小时左右; 二级瓶(含有 200 mL 液体 LB 培养基的锥形瓶培养基)培养:加 0.1 %抗性,37℃,180 rmp 摇床培养 2 小时左右至菌液浓度 OD600达到 0.6 ~ 0.8 左右,加入诱导剂 IPTG 使其终浓度达到 1 mM,诱导后培养方法有三。其一,37 ℃摇床培养 7 小时左右;其二,25 ℃摇床培养 12 小时左右;其三,16 ℃摇床培养 15 小时左右;

  2) 大肠杆菌固体培养:

  将涂布后的平板置于 37 ℃培养箱培养 14 小时左右。

  2.2.1.3 大肠杆菌菌种保藏

  从平板上挑取单菌落,接入一级瓶培养,取新鲜菌液加入甘油至甘油终浓度达 30 % —20℃保藏;

  2.2.1.4 DNA 酶切

  根据相关试剂使用说明书,在 PCR 管中依次加入如下试剂:双蒸水、内切酶、Buffer,通常采用的酶切体系总体积为 20 μL 或 40 μL。选取适宜的酶切温度孵育一定时间,酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

  2.2.1.5 DNA 连接

  根据相关试剂使用说明书,在 PCR 管中依次加入如下试剂:DNA、连接酶、Buffer,通常采用的连接体系总体积为 10 μL。选取适宜的连接温度孵育一段时间。

  2.2.1.6 核酸琼脂糖凝胶电泳

  1) 根据待分析核算样品的分子量配置适宜浓度的琼脂糖凝胶。此处以 1 %(m/V)的琼脂糖凝胶进行说明。称取 1g 琼脂糖 G-10,加入 100 mL 1×TAE 缓冲液中,在微波炉中加热融化,摇匀即配置成 1 %琼脂糖凝胶;

  2) 选取合适的梳子插入胶模,将稍适冷却的琼脂糖凝胶倒入胶模中,依据实验需要选择合适的凝胶厚度,室温冷却 30 min 以上以使其充分凝固。将凝固后的凝胶从胶模中取出放入电泳槽中;

  3) 向电泳槽中加入 1×TAE 缓冲液至电泳槽内液面高度没过凝胶上表面约 1 mm;

  4) 将待分析核算样品与上样缓冲液充分混匀,用微量移液器将样品加至凝胶孔中;

  5) 盖上电泳槽,接通电源,80V ~100V 恒压电泳;

  6) 待溴酚蓝迁移至适当位置时停止电泳,取出凝胶,在凝胶成像仪中观察电泳结果并摄影保存。

  2.2.1.7 薄型琼脂糖凝胶回收试剂盒回收 DNA 凝胶

  1) 用干净锋利的手术刀片切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶胶块,应在切干净的前提下切下尽可能小的胶块,且胶块重量尽可能小于 400 mg,将切下的胶块置于 1.5 mLEP管中;

  2) 根据切下胶块的重量,以 100 mL/ 100 mg 的比例向 EP 管中加入 Binding Buffer,在 50 ~60 ℃水浴条件下融化胶块,间隔 2 ~3 min 振荡几下直至胶块完全融化;

  3) 将融化后的混合物转移至套放在 2 mL 收集管中的 GenClean 收集管中,室温静置 2 min,离心(6000 rmp, 1min),倒掉收集管中的废液;

  4) 将吸附柱重新放回收集管中,向收集管中加入 500 μL Wash Solution,离心(12000 rmp, 1 min),倒掉收集管中的废液;

  5) 重复上个步骤一次;

  6) 将吸附柱重新放回收集管中,离心(12000 rmp, 1 min)以彻底除去 Wash Solution;

  7) 将吸附柱转移至 1.5 mL 离心管,放到 37 ℃培养箱 10 min 以彻底除去 Wash Solution 中的乙醇;

  8) 在吸附柱膜中央加入 30 ~50 μL Elution Buffer,室温静置 2 min,离心(12000 rmp, 1 min),离心管中收集到的即为包含有目的核酸的溶液;

  9) 取 2 ~ 5μL 进行琼脂糖凝胶电泳以检测回收产物浓度,纯化完毕的 DNA 可立即用于后续实验或-20 ℃冻存。

  2.2.2 蛋白表达与纯化

  将重组质粒 TCS-pET28b 转化入大肠杆菌表达菌感受态细胞 BL21(DE3),挑取单菌落接入含 50 μg/mL 卡那霉素(Kan)抗性的 30 mL 液体 LB 培养基(一级瓶)中,37 ℃过夜培养 14 小时左右。以 4 %的接种量将一级瓶菌液接种于含 50 μg/mL 卡那霉素(Kan)抗性的二级瓶,37 ℃培养 2 小时左右至菌液浓度 OD600达到 0.6~0.8 左右,向二级瓶中加入诱导剂 IPTG,使其终浓度达到 1 mM。诱导后置于 16 ℃培养 14 ~ 16小时左右。收菌,离心(3000 rmp, 20 min)收集菌体沉淀。重悬得到的菌液进行超声破碎(200 W,工作 5 s,间隔 5 s,99 个循环)。破碎液离心(12000 rmp, 20min)分离上清与包涵体。根据验证性表达的结果选择上清纯化。具体步骤如下:

  1) 选取 Ni2+-NTA 亲和层析柱,用 5 倍柱体积的超纯水洗涤介质,然后用 3 倍左右柱体积的平衡液(20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 %甘油, pH = 8.5)平衡柱子至其流出液的 pH 与平衡液相同;

  2) 待柱子平衡之后,柱内液面高度基本与介质齐平时,缓慢加入蛋白上清液,同时保持流出液速度为 4 s/滴;

  3) 上样结束后,首先用 5 倍柱体积洗涤介质以去除核酸等可能吸附的杂质;然后用 5 倍柱体积洗涤液(20 mM 咪唑,20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 %甘油, pH = 8.5)洗涤介质以除去弱吸附的杂蛋白;

  4) 5 倍柱体积洗脱缓冲液(200 mM 咪唑,20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 %甘油, pH = 8.5)洗脱目标蛋白,并以 1 mL/EP 管收集洗脱蛋白样品;

  5) 检测被收集样品的 A280,收集峰值处的蛋白样品待用;

  6) 用 1M 咪唑缓冲液(1M 咪唑,20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 %甘油, pH = 8.5)洗涤所有可能强吸附的蛋白;

  7) 用 5 倍柱体积的超纯水洗涤介质以使其恢复中性环境,再用 3 倍柱体积的 20 %乙醇封存柱子待用; 将收集待用的蛋白洗脱样品装入孔径为 10 kD 的透析袋中,另取一定体积的洗脱缓冲液作为对照组同步透析。将透析袋置于透析液(20 mM Tris-HCl,0.5 M NaCl,10 %甘油,pH = 7.2)中,透析杯置于冰水浴中。每 2 小时更换一杯透析液,连续透析三杯即 6 小时。收集透析完成的蛋白样品,用孔径为 0.22 μm 的滤头过滤除菌,分装于 PCR管,-80 ℃保存待用,对照组同步分装。同时取样,用 BCA 蛋白定量试剂盒测定透析后蛋白样品的蛋白浓度。

  2.2.2.1 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳

  1) 将清洗干净并烘干的玻璃板搭建起来,按照分离胶配方配制分离胶;

  2) 将混匀充分的分离胶迅速灌注到两玻璃板中间,预留出约 2 倍梳孔高度的空间,用无水乙醇液封,室温放置待其凝固;

  3) 将凝固充分的分离胶上层乙醇倒掉,并用吸水纸吸干残留的乙醇;

  4) 按照浓缩胶配方配置浓缩胶,并将其迅速灌注到分离胶上层,室温放置待其凝固;

  5) 将凝固充分的 SDS-PAGE 凝胶转移至电泳槽中,在两套玻璃板中央加入 1×SDS PAGE 缓冲液至溢出;

  6) 小心拔掉梳子,依序加样;

  7) 接通电源,设置电压(浓缩胶 8 V/cm, 分离胶 15 V/cm),恒压电泳;

  8) 待溴酚蓝迁移至分离胶底部时停止电泳,取出凝胶并将其转移至染色液中;

  9) 染色 2 小时左右,回收染色液并加入脱色液,脱色过夜,期间更换 2~3 次脱色液;

  10) 在凝胶成像仪上观察脱色充分的凝胶并摄影保存;

  2.2.3 表达与纯化的蛋白相关抗肿瘤效果实验

  2.2.3.1 细胞培养 过程不用太细!

  A. 细胞复苏:37℃预热细胞培养液并转入超净台待用,从液氮中取出Hela、B16、MCF-7、MRC-5细胞冻存管并立即置于 37 ℃水浴中,轻轻晃动冻存管至其融化,冻存管转入超净台,将细胞悬液转移至 10 mL 离心管,离心(500 rmp, 5 min)弃上清。向离心管中加入预热的细胞培养液并重悬细胞,将其转入细胞培养瓶并置于 CO2培养箱。

  B. 细胞换液:弃去原有培养液,向培养瓶中加入 2 mL 37 ℃预热的 PBS 并轻轻晃动,清晰两次,加入适量新鲜预热的培养液并转移至 CO2培养箱继续培养;

  C. 细胞消化与传代培养:弃去原有培养液 PBS 清洗两遍,向培养瓶中加入 500 μL胰酶消化液(含 EDTA)消化数分钟至显微镜下可见细胞变园、肉眼可见细胞之间出现缝隙时立即加入新鲜培养基,用移液器缓慢吹打至细胞分散为单个。将细胞悬液转入 10 mL 离心管,离心(500 rmp, 5 min)弃上清。向离心管中加入新鲜培养基并悬浮细胞,一般以一传三的方法传到新的培养品,将培养瓶转移至 CO2培养箱继续培养。

  2.2.3.2 MTT 实验

  1) 取对数期Hela、B16、MCF-7、MRC-5细胞消化并加入新鲜培养基悬浮细胞,血球计数板计数,按照10000 个细胞/孔接种于 96 孔板,过夜培养至贴壁;

  2) 依次加入浓度梯度的药物蛋白(0 μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM)并用无血清培养基补齐至 200 μL,每个浓度设置5 个复孔,37 ℃孵育48h;

  3) 弃去培养基,每孔加入 200 μL 含有 10 % MTT 的无血清培养基工作液,37 ℃孵育 4 小时;

  4) 小心弃去培养基,每孔加入 180 μL DMSO,转置摇床振荡使其结晶充分溶解;

  5) 用酶标仪测定 A490,并据此推算存活率,以推断药物蛋白的抗肿瘤效果。

  2.2.3.3 流式细胞术检测

  1) 将对数期生长细胞消化并用新鲜培养基重悬,以 1000000 个细胞/孔接种于六孔板,过夜培养至贴壁;

  2) 依次加入浓度梯度的药物蛋白并用无血清培养基补齐至 2 mL, 37 ℃孵育2 d;

  3) 吸取培养孔内的培养基转移至对应的 10 mL 离心管,做好标记;

  4) 每孔用 1 mLPBS 洗涤两次,洗涤液转移至对应的 10 mL 离心管;

  5) 每孔用 200 μL 无 EDTA 胰酶消化,消化后单细胞悬液转移至对应的 10 mL 离心管;

  6) 离心(1000 rmp, 8 min),弃上清;

  7) PBS 洗涤一次,弃上清;

  8) 每管用 400 μL 结合缓冲液重悬;

  9) 每管 10 μLAnnexin V-FITC,混匀,4 ℃避光孵育 10 min;

  10) 每管 5 μL PI,混匀,4 ℃避光孵育 5 min;

  11) 1小时以内用流式细胞仪进行检测,分析细胞存活率。

  2.2.3.4 N-糖苷酶活性检测

  1) 参考 Promega 公司兔网织红细胞裂解系统使用说明书,设置反应体系:

  表 2.12 兔网织红细胞裂解系统反应体系

  Table 2.12 reaction system for reticulocyte lysis system of rabbit reticulum

  组分体积

  TNTòRabbit Reticulocyte Lysate25ml

  TNTòReaction Buffer2ml

  TNTò RNA Polumerase (SP6. T3 or T7)1ml

  Amono Acid Mixture. Minus Methionine. 1 Mm1ml

  [35S]methionine (1000Ci/mmol at 10Mc/ml)2ml

  RNasinò Robonuclease Inhibitor(40mg/ml)1ml

  Luciferase Control DNA(0.5mg/ml)2ml

  Nuclease-Free Water to a final volume of 50ml

  2) 依次加入浓度梯度的药物蛋白至上述反应体系,37 ℃水浴孵育 1.5 小时;

  3) 取上述反应液 2.5 μL,加入 50 μL 萤光素酶底物,混匀,转置白板,用化学发光检测仪检测荧光值,以判断N-糖苷酶活性。

  2.2.3.5 拓扑异构酶活性检测

  参考双酶切反应体系设置质粒切割体系,其中,质粒 6 μL,蛋白药物 2 μL 至其终浓度达 0.1μg/μL,用双蒸水补齐至 20 μL 体系,37 ℃水浴孵育 1 小时,用 1 %琼脂糖凝胶电泳检测,根据电泳结果判断拓扑异构酶的作用效果,以检测拓扑异构酶活性。

  2.2.3.6 融合蛋白穿膜效果检测

  为考察重组蛋白 TCS 与融合蛋白 TCS-HBP 的穿膜效果,将其分别偶联异硫氰酸荧光素(FITC),以 Hela 细胞为细胞模型,分别以一定浓度梯度(1μM、2μM、3μM)处理 Hela 细胞,37 ℃孵育 24 小时。以不含药物蛋白的洗脱缓冲液作为对照。经激光共聚焦显微镜成像。

  A. FITC 标记融合蛋白

  向待交联蛋白样品中加入 FITC(1 mg/mL),体系置于交联缓冲液(0.1 M NaHCO3, pH = 9.5)孵育 2 小时,体系转移至透析液(PBS,pH = 7.2)透析三杯以除尽游离的 FITC,体系注意避光;

  B. 激光共聚焦检测

  1) 细胞消化重悬,计数,以 10000 个细胞/孔接种在置于 24 孔板中的圆形盖玻片上,37 ℃过夜培养至贴壁;

  2) 弃去培养基,加入梯度浓度的交联融合蛋白,培养基补齐至 500 μL,37 ℃孵育一定时间;

  3) 弃去培养基,500 μL PBS 洗三遍,每遍轻轻洗 3 分钟,400 μL 预冷 4 % 多聚甲醛(PFA),4 ℃固定 30 分钟;

  4) 500 μL PBS 洗三遍,每遍轻轻洗 3 分钟,超纯水洗一遍;

  5) 用镊子将玻片放到载玻片上,加适量 DAPI 染色,5 分钟后弃去,超纯水洗一遍;

  6) 盖盖玻片,滴加适量 70 % 甘油封片,用指甲油固定封闭,然后放在荧光显微镜下观察。

  2.2.3.7 融合蛋白凋亡途径检测

  已有文献报道,TCS 可通过引起肿瘤细胞坏死,协同细胞凋亡共同作用于肿瘤细胞死亡[29]。采用 Hoechst / PI 双染法考察 TCS 与 TCS-HBP 引起肿瘤细胞 Hela 细胞坏死情况。

  1) 细胞按 1000000 个/孔接种于六孔板,培养至贴壁,加入浓度梯度的蛋白药物孵育,消化、离心收集细胞,每孔 150 μLRIPA 裂解液(含 1 % PMSF)吹打细胞至裂解完全,离心,取上清定蛋白浓度,13.5 % SDS-PAGE;

  2) 将 PVDF 膜放在 100 %甲醇浸泡 10 秒,与滤纸一同放在电转 Buffer 浸泡 30 分钟;

  3) 去除浓缩胶,在分离胶 Marker 位置切角标记;

  4) 依序搭建转膜套件:黑孔板(负极)、纤维垫、滤纸、蛋白凝胶、PVDF 膜、滤纸、纤维垫、白孔板。注意避免各层之间产生气泡;

  5) 扣上锁扣,放入加有电转液的电转槽中,100 V 恒压,2~3 小时;

  6) 电转完毕,取出 PVDF 膜,Marker 部分剪下并标记,单独染色脱色;

  7) 其余 PVDF 膜置于 PBS(5 %脱脂奶粉、0.5 %吐温)中,4℃封闭过夜;

  8) 取出 PVDF 膜,PBS(0.1 %吐温)洗涤三次,每次摇床 10 分钟;

  9) 以 1:1000 比例稀释一抗至 PBS(1%脱脂奶粉、0.5 %吐温),浸入 PVDF 膜,室温孵育过夜;

  10) 取出 PVDF 膜,PBS(0.1 %吐温)洗涤三次,每次摇床 10 分钟;

  11) 5 mL 显色液反复淋洗 PVDF 膜,显色效果适中,立即加入去离子水终止显色,成像仪摄影保存。

  3 结果与分析

  3.1 重组质粒的构建

  根据 DNA Marker 指示,所有条带均符合理论大小。对于菌落 PCR 检测到的阳性克隆,测序分析,其序列与理论序列完全一致,表明构建成功。

  The construction of recombinant plasmid in Figure 3-1

  注:(A)目的基因 TCS PCR 检测; (B) 目的基因 TCS PCR 产物纯化检测; (C)载体质粒 EGFP-HBP-pET28b 抽提;

  (D) 目的基因 TCS与载体质粒EGFP-HBP-pET28b分别双酶切结果; (E)切胶回收产物连接前检测; (F)菌落 PCR; M:DNA Marker; 1、2:TCS PCR 产物; 3:TCS PCR 纯化产物; 4、5:EGFP-HBP-pET28b; 6、7:TCS 双酶切; 8、9:EGFP-HBP-pET28b 双酶切; 10、11:TCS 切胶回收; 12、13:EGFP-HBP-pET28b 切胶回收; 14、15:TCS 菌落 PCR 目的基因 TCS 理论大小为 755bp,载体质粒 pET28b 大小为 5kb 左右。

  3.2 融合蛋白的表达与纯化

  3.2.1 重组蛋白 TCS 的表达与纯化 诱导条件不用摸索吗?

  重组蛋白 TCS 理论分子量为 27 kDa,如图 3-2 所示,诱后重组蛋白得到明显表达,经平衡液与洗涤液分别洗涤,然后用洗脱液(200 mM 咪唑)洗脱,洗脱获得的目标蛋白 TCS 中基本无杂蛋白,认为成功制备获得目标蛋白 TCS。

  The purification and analysis of recombinant protein TCS TCS

  注:M:蛋白 Marker; 1:TCS 诱前; 2:TCS 诱后; 3:TCS 上清; 4:TCS 包涵体; 5:TCS 穿出; 6:平衡液(0 mM 咪唑)洗涤; 7:洗涤液(20 mM 咪唑)洗涤; 8:洗脱液(200 mM 咪唑)洗脱

  3.2.2 融合蛋白 TCS-HBP 的表达与纯化

  融合蛋白 TCS-HBP 理论分子量为 29 kDa,如图 3-3 所示,诱后重组蛋白得到明显表达,经平衡液与洗涤液分别洗涤,然后用洗脱液(200 mM 咪唑)洗脱,洗脱获得的目标蛋白 TCS-HBP 中基本无杂蛋白,认为成功制备获得目标蛋白 TCS-HBP。

  Purification and analysis of fusion protein TCS-HBP TCS-HBP

  注:M:蛋白 Marker; 1:TCS-HBP 诱前; 2:TCS-HBP 诱后; 3:TCS-HBP 上清; 4:TCS-HBP 包涵体; 5:TCS-HBP 穿出; 6:平衡液(0 mM 咪唑)洗涤; 7:洗涤液(20 mM 咪唑)洗涤; 8:洗脱液(200 mM 咪唑)洗脱; 9:1 M 咪唑洗涤; 10:TCS-HBP 透析后样品

  3.3 融合蛋白体外抑制细胞活性分析——MTT 实验

  根据什么结果说有毒性????总体来看,重组蛋白 TCS 与融合蛋白 TCS-HBP 对子宫颈癌细胞 Hela 细胞、鼠黑色素瘤细胞 B16 细胞、人乳腺癌细胞 MCF-7 以及正常细胞人胚胎成纤维细胞 MRC-5 细胞都存在一定细胞毒性,且融合了穿膜肽 HBP 的重组蛋白 TCS 具有更强的细胞毒性,这种差异在三种癌细胞中体现地尤为明显。这表明穿膜肽可以有效地介导药物蛋白 TCS 进入胞内从而发挥其细胞毒性。

  重组蛋白 TCS 与融合蛋白 TCS-HBP 对以上四种细胞的细胞毒性都具有浓度依赖性且为正相关。 TCS 对 Hela 细胞与 B16 细胞的细胞毒性要明显低于其对于MCF-7 细胞与 MRC-5 细胞的细胞毒性。

  Figure 3-4 MTT analysis of the cytotoxicity of target proteins to cancer cells and normal cells in vitro

  3.4 融合蛋白穿膜能力分析

  融合蛋白 TCS-HBP 相对于 TCS 而言具备更强的穿膜效果,且 TCS 与 TCS-HBP 的穿膜效果均呈现浓度依赖性。TCS-HBP在低浓度(1.0 μM)下的穿膜效果要优于 TCS 高浓度(3.0 μM)下的穿膜效果。

  Figure 3-5 detection of the effect of TCS and TCS-HBP on the membrane

  3.5 融合蛋白特征生物学活性检测

  3.5.1 N-糖苷酶活性检测

  由图 3-6 可知,TCS 与 TCS-HBP 都具有体外抑制蛋白翻译能力,即 N-糖苷酶活性不受影响且 N-糖苷酶活性表现出浓度依赖性。当蛋白浓度达到 10 pM 时已经可以有效抑制萤光素酶翻译且 TCS 与 TCS-HBP N-糖苷酶活性相当。 表明融合穿膜肽并未影响 TCS 作为核糖体失活蛋白所具有的特征性生物学活性——N-糖苷酶活性。

  Figure 3-6 activity detection of TCS and TCS-HBP N- glucosidase

  3.5.2 拓扑异构酶活性检测

  实验结果描述不清数!!如图3-7 所示,从图可知,TCS 与 TCS-HBP 都具有核糖体失活蛋白特征生物学活性——拓扑异构酶活性。TCS 与 TCS-HBP 的拓扑异构酶活性都具有时间依赖性与浓度依赖性,且相同时间相同浓度条件下,TCS-HBP 的拓扑异构酶活性高于TCS。

  综上,融合穿膜肽后对于 TCS 作为核糖体失活蛋白的特征生物学活性——N-糖苷酶活性与拓扑异构酶活性没有所影响。

  Figure 3-7 TCS and TCS-HBP topoisomerase activity detection

  3.6 融合蛋白细胞凋亡与坏死检测

  Hela 细胞经 Hoechst / PI 双染料孵育 24 小时,TCS 与 TCS-HBP 均可引起细胞坏死(双阳性),并可能引起细胞凋亡(凋亡早期细胞呈 Hoechst 单阳性)。相对于 TCS 而言,融合穿膜肽的 TCS-HBP 具有更为显著的引起 Hela 细胞坏死的能力,这有利于协同细胞凋亡从而共同贡献于肿瘤细胞死亡。双阳性、单阳性判断标准均需在方法描述中完成。在结果中仅就你的研究数据进行相关描述,说明什么?

  表 3.1 Hoechst / PI 双染检测细胞坏死

  Table 3.1 Hoechst / PI double staining for detection of cell necrosis

  染料正常活细胞早期凋亡细胞中晚期凋亡细胞坏死细胞

  Hoechst++++++

  PI--++

  Figure 3-8 Hoechst / PI double staining for detection of cell necrosis

  3.7 融合蛋白流式凋亡检测

  要有数据支撑!!向读者描述清楚!否则,你这样的语句可以随便编!!由图 3-9 可知,经 TCS 与 TCS-HBP 处理后,B16 细胞与 Hela 细胞均呈现由正常细胞向早期凋亡细胞继而向中晚期凋亡及坏死细胞迁移的趋势。这一趋势包括以下几个方面:其一,这一迁移趋势呈现出浓度依赖性;其二,同种细胞相同浓度下,TCS-HBP 的迁移趋势较 TCS 更为显著。这两方面趋势表明 TCS 与 TCS-HBP 诱导细胞凋亡具有浓度依赖性,穿膜肽 HBP 的加入可以显著提高 TCS 诱导细胞凋亡能力,从而协同诱导细胞坏死共同贡献于肿瘤细胞死亡。

  由表3.3 可知,细胞凋亡率与散点图所呈现的趋势完全一致,表明以上推测合理。

  表 3.2 Annexin V-FITC / PI 双染检测细胞凋亡

  Table 3.2 Annexin V-FITC / PI double staining to detect cell apoptosis

  染料正常活细胞早期凋亡细胞中晚期凋亡细胞坏死细胞死亡细胞

  AnnexinV-FITC-+++-

  PI--+++

  Figure 3-9 Annexin V-FITC / PI double staining to detect cell apoptosis

  注:Q1:死亡细胞; Q2:晚期凋亡与坏死细胞; Q3:早期凋亡细胞; Q4:正常细胞; Q5:死亡细胞; Q6:晚期凋亡与坏死细胞; Q7:早期凋亡细胞; Q8:正常细胞;

  表3.3 Annexin V-FITC / PI 双染检测细胞凋亡率

  细胞TCSTCS-HBP

  0.25μM0.5μM1.0μM0.25μM0.5μM1.0μM

  B1618.7%21.3%43.8%40.9%60.9%76.6%

  Hela12.5%13.4%20.0%45.1%64.4%79.0%

  3.8 融合蛋白诱导凋亡途径分析

  3.8.1 流式细胞术分析凋亡途径

  此部分也需要有相关数据来说明!!由图 3-11 及表 3.5 可知,Caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK 与融合蛋白 TCS-HBP 共孵育可以显著抑制 Hela 细胞凋亡,且 Z-VAD-FMK 的抑制效果呈现浓度依赖性。由此可以推测,融合蛋白 TCS-HBP 诱导 Hela 细胞凋亡途径中涉及 Caspase 效应物,为进一步确定其具体凋亡途径,可以选取 Western Blot 在蛋白翻译水平上对 Caspase 相关凋亡途径中的效应物进行检测。

  Figure 3-11 TCS-HBP cell apoptosis inhibition detection

  注:(A)阳性对照组,4 个平行; (B)阴性对照组,2 个平行; (C)实验组 1; (D)实验组 2

  表 3.5 TCS-HBP 诱导 Hela 细胞凋亡率

  Table 3.5 TCS-HBP induced apoptosis rate of Hela cells

  组别凋亡率

  1.0μM TCS-HBP81.0%85.5%80.4%79.9%

  1.0μM TCS-HBP 5mMZ-VAD-FMK66.1%68.4%

  1.0μM TCS-HBP 20mMZ-VAD-FMK57.8%51.2%

  3.8.1 Western Blot 分析凋亡途径

  Western Blot 是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白质的方法,具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白质分析的一种常规技术。Western Blot 可在蛋白翻译水平上对 Caspase 相关凋亡途径中的效应物进行检测。Bcl-2、cleaved-caspase-3 是线粒体凋亡途径中的关键效应物,通过检测其表达水平可以推知 TCS-HBP 是否通过线粒体途径诱导 Hela 细胞凋亡(图 3-12)。GAPDH或 G3PDH 即甘油醛-3-磷酸脱氢酶,该酶是糖酵解反应中的一个酶,由 4 个 30~40kDa的亚基组成,分子量 146kDa。该酶基因为管家基因,因此几乎在所有组织中都高水平表达,在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的,且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定,故被广泛用作抽提 total RNA,Western blot 等实验操作的标准化的内参。除 GAPDH 外,常用的内参有,ACTB(β-actin)、18S 等。此部分文字可放到综述或讨论中!!!

  图 3-12 TCS-HBP 诱导细胞凋亡效应物检测

  Figure 3-12 TCS-HBP induced apoptosis effector detection

  由图 3-12 可知,在各组内参 GAPDH 基本一致的前提下,其余效应物的检测结果可信。其中,cleaved-caspase-3 表达水平存在显著上调,而Bcl-2 表达水平存在显著下调,同时,这些上调与下调基本呈现浓度依赖性,TCS-HBP 引起的调整幅度比 TCS 本身更为显著。这一检测结果与细胞凋亡线粒体途径中各个效应物理论表达水平的调整趋势完全吻合,由此可以推知,TCS 与 TCS-HBP 可能通过线粒体途径诱导 Hela 细胞凋亡,且TCS-HBP 诱导细胞凋亡的效果较 TCS 而言更为显著。依据什么说是显著变化?应该有相关数据且进行统计分析!!

  4 讨论与分析

  4.1 重组质粒的构建与融合蛋白的表达及纯化

  实验室保藏有质粒 TCS-pET28b 与 EGFP-HBP-pET28b,在此基础上构建目标质粒TCS-HBP-pET28b。在此构建与表达纯化过程中存在以下几点需要考虑:

  1.限制性核酸内切酶的选择:由于 TCS-pET28b 中 TCS 与 EGFP-HBP-pET28b 中EGFP 两端存在相同的酶切位点,即 NcoI 与 BamHI,因此,无需在设计引物时引入新的酶切位点;

  2.鉴定阳性克隆策略的选取:连接后重组质粒转化克隆菌并涂布于抗性平板,培养后得到单菌落。此时,为排除可能存在的假阳性克隆可在 DNA 水平上采取以下两种策略:酶切鉴定与菌落 PCR 鉴定。其中,酶切鉴定的适用条件要求新插入的目的基因片段与载体上被替换掉的原有片段存在一定大小差异且该差异可以在琼脂糖凝胶电泳分析中被观察到。考虑到本研究的构建中新插入的目的基因 TCS 片段大小约为 755bp,而载体上被替换掉的原有片段 EGFP 大小约为 723bp,这种程度的大小差异在 1 %琼脂糖凝胶电泳分析中不易被观察到,因此不采用这种鉴别方法。菌落 PCR 鉴定可以快速实现对于大量单菌落的鉴定,不受插入与替换片段大小影响。因此本研究中采取菌落 PCR 鉴定单克隆是否为阳性克隆。

  3.表达载体的选择:根据本实验室以往实验,在蛋白药物 C 端融合表达的穿膜肽可能存在一定的降解,同时考虑到本研究采用组氨酸标签亲和层析纯化目标蛋白这一机理,选择组氨酸标签位于 C 末端的 pET28b 载体。实验结果表明,据此设计可以获得纯度较高的目标蛋白。

  4.上清纯化的选择策略:验证性表达结果表明,该融合蛋白在 16 ℃诱导后上清表达量显著高于包涵体表达量,因此选取上清纯化,这样可以获得生物活性保持更佳的融合蛋白。当遇到目标蛋白包涵体表达量较高的情况,通常有两种策略:包涵体纯化与更换表达载体。其中,包涵体纯化工艺复杂,且得到的目标蛋白生物活性可能会存在一定的损失。更换表达载体是指更换为融合促可融标签的表达载体,如融合 Trx 标签的 pET32a载体等。

  4.2 重组蛋白体外抑制细胞活性分析——MTT 实验

  总体来看,融合了穿膜肽 HBP 的重组蛋白 TCS 相对于单独的 TCS 本身而言具有更强的细胞毒性,这种差异在三种癌细胞中体现地尤为明显。这表明穿膜肽可以有效地介导药物蛋白 TCS 进入胞内从而发挥其细胞毒性。 重组蛋白 TCS 与融合蛋白 TCS-HBP 对以上四种细胞的细胞毒性都具有浓度依赖性且为正相关。就重组蛋白 TCS 而言,TCS 对 Hela 细胞与 B16 细胞的细胞毒性要明显低于其对于MCF-7 细胞与 MRC-5 细胞的细胞毒性,这是与 TCS 本身穿膜机理相关联的。TCS 主要通过低密度脂蛋白受体相关蛋白(LDL Receptor Related Protein, LRP)介导的内吞作用进入细胞,而不同细胞膜外表面 LRP 的含量不尽相同,因此相同条件下 TCS 本身进入不同种细胞系细胞的数量存在一定差异,这种差异可以通过 MTT 实验观测到并通过细胞存活率(或抑制率)表现出来。

  TCS 作为大分子抗肿瘤蛋白药物,受限于其自身的穿膜机理而无法有效作用于部分TCS 不敏感的癌细胞,且对于 TCS 敏感细胞的作用较为有限。以此为出发点,本研究通过将 TCS 与可以高效介导生物活性大分子穿膜的穿膜肽融合表达,辅助 TCS 穿膜,以期提高 TCS 对于癌细胞细胞膜的穿透能力并扩展 TCS 敏感细胞的细胞谱,为 TCS 高效用药提供有效参考。

  值得注意的是,融合蛋白中穿膜肽 HBP 是一段富含碱性氨基酸的多肽,TCS 同样富含碱性氨基酸且理论等电点约为 9.17,在低于其等电点的 pH 环境中带正电荷,基于细胞膜外表面带负电荷磷脂的存在这一事实,穿膜肽与 TCS 在静电相互作用下容易结合到细胞膜外表面从而实现后续内吞过程。考虑到肿瘤细胞周围是微酸性环境,穿膜肽与TCS 在此环境中将带有相对更高的正电荷,从而更趋向于富集到肿瘤细胞膜外表面而非正常细胞膜外表面。从这个角度看,融合蛋白中 TCS 与穿膜肽这两个部件都会对融合蛋白趋向于富集到肿瘤细胞细胞膜外表面而非正常细胞细胞膜外表面有所贡献,这可以理解为该融合蛋白具有一定的靶向效果。当然,实际的靶向效果需要通过实验进一步论证。此外,为提高融合蛋白的靶向效果以提升蛋白药物特异性靶向肿瘤细胞的能力,通常的策略是以肿瘤细胞细胞膜外表面特异性受体如过量表达的表皮生长因子受体(EGFR)为靶点,通过将靶向肽表皮生长因子样多肽融合表达到蛋白药物以提升其整体的靶向效果。即蛋白药物——靶向肽——穿膜肽融合表达策略是提升蛋白药物穿膜效果、细胞毒性以及靶向特异性的重要策略,为提升蛋白药物良好的应用前景提供新思路。

  4.3 融合蛋白穿膜能力分析

  依据 MTT 实验结果,TCS 与 TCS-HBP 都对于 Hela 细胞具有一定细胞毒性,因此Hela 细胞应属于 TCS 相对敏感细胞。选取 Hela 细胞为细胞模型,将 TCS 与 TCS-HBP分别偶联 FITC,两者共孵育一段时间后,经激光共聚焦显微镜成像,即可观察到 TCS与 TCS-HBP 的穿膜效果并分析差异。结果表明穿膜肽 HBP 的融合表达可有效提升 TCS本身的穿膜效果,从而介导大分子抗肿瘤蛋白药物 TCS 高效进入肿瘤细胞发挥其抗肿瘤活性。这对于 TCS 的药用前景具有积极意义。

  4.4 融合蛋白特征生物学活性检测

  已有研究表明,TCS 作为 I 型核糖体失活蛋白,同样具备核糖体失活蛋白共有的特征生物学活性,即 N-糖苷酶活性与拓扑异构酶活性。同时,TCS 的这些生物学活性与其抗肿瘤活性具有一定关联,因此,有必要考察融合穿膜肽后对于 TCS 作为核糖体失活蛋白的特征生物学活性是否有所影响。本研究通过兔网织红细胞裂解系统以及超螺旋质粒切割实验,考察 TCS 及其融合蛋白的 N-糖苷酶活性与拓扑异构酶活性。实验结果表明,融合穿膜肽后对于 TCS 作为核糖体失活蛋白的特征生物学活性——N-糖苷酶活性与拓扑异构酶活性没有所影响,并且,TCS-HBP 的拓扑异构酶活性有所提升。

  4.5 融合蛋白细胞凋亡与坏死检测

  已有文献报道,TCS 可通过引起肿瘤细胞坏死,协同细胞凋亡共同作用于肿瘤细胞死亡。因此有必要考察 TCS-HBP 引起肿瘤细胞坏死情况。本研究采用 Hoechst / PI 双染法进行测定。实验结果表明,相对于 TCS 而言,融合穿膜肽的 TCS-HBP 具有更为显著的引起 Hela 细胞坏死的能力,这有利于协同细胞凋亡从而共同贡献于肿瘤细胞死亡。为进一步确定 TCS-HBP 是否确实可以引起细胞凋亡,本研究采用流式细胞术进行细胞凋亡检测。

  4.6 融合蛋白流式凋亡检测

  已有文献报道,TCS 可通过引起肿瘤细胞凋亡,协同细胞坏死共同作用于肿瘤细胞死亡。本研究采用 Annexin V-FITC/PI 双染法考察 TCS-HBP 引起肿瘤细胞 B 16 及 Hela细胞坏死情况。实验结果表明,经 TCS 与 TCS-HBP 处理后,B16 细胞与 Hela 细胞均呈现由正常细胞向早期凋亡细胞继而向中晚期凋亡及坏死细胞迁移的趋势。这一趋势包括以下几个方面:其一,这一迁移趋势呈现出浓度依赖性;其二,同种细胞相同浓度下,TCS-HBP 的迁移趋势较 TCS 更为显著。这两方面趋势表明 TCS 与 TCS-HBP 诱导细胞凋亡具有浓度依赖性,且穿膜肽 HBP 的加入可以显著提高 TCS 诱导细胞凋亡能力,从而协同诱导细胞坏死共同贡献于肿瘤细胞死亡。

  4.7 融合蛋白诱导凋亡途径分析

  对于 TCS 及 TCS-HBP 诱导的细胞凋亡途径与机理的清楚把握将有助于掌握 TCS 及TCS-HBP 药理性质,从而有助于为其临床用药提供有益指导。 根据已有文献报道,TCS 诱导肿瘤细胞凋亡凋亡信号转导主要存在三种途径:即死亡受体途径(又称外在途径)、线粒体途径(又称内在途径)以及内质网途径。这三种凋亡途径的上游事件不同,但存在共用的凋亡相关效应物,最终都要通过级联反应激活半胱天冬酶(caspase)以达到细胞凋亡目的。 本研究采用流式细胞术,通过 Caspase 抑制剂 Z-VAD-FMK 与蛋白药物共孵育考察TCS 与 TCS-HBP 诱导的细胞凋亡途径涉及 Caspase,然后采用 Western Blot 进一步检测,实验结果表明 TCS 与 TCS-HBP 可能通过线粒体途径诱导 Hela 细胞凋亡。至于 TCS与 TCS-HBP 诱导细胞凋亡是否确实包括线粒体通路,以及是否存在死亡受体途径(即外在途径)、内质网途径等其他途径,需要针对这些途径中的效应物进行进一步检测,该检测正在进行。


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